體內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞(EC)持續(xù)暴露于血流的機(jī)械微環(huán)境中，流體剪切力在EC行為中發(fā)揮著重要作用。需要產(chǎn)生生理和病理相關(guān)搏動(dòng)流的新方法來(lái)理解不同剪切力下EC行為。本文展示了***種自適應(yīng)泵(Adapt-Pump)平臺(tái)，通過(guò)基于定量成像的信號(hào)傳導(dǎo)，從人多能干細(xì)胞衍生的心臟球體(CS)中產(chǎn)生搏動(dòng)流/脈動(dòng)流。Adapt-Pump系統(tǒng)產(chǎn)生的搏動(dòng)流可以重現(xiàn)獨(dú)特的CS收縮特性，準(zhǔn)確模擬對(duì)臨床相關(guān)藥物的反應(yīng)，并模擬CS在流體機(jī)械刺激下的收縮變化。我們發(fā)現(xiàn)，在長(zhǎng)QT綜合征衍生的病理性搏動(dòng)流下分化的EC表現(xiàn)出異常的EC單層組織。這種Adapt-Pump平臺(tái)為心血管系統(tǒng)建模和提高我們對(duì)不同機(jī)械微環(huán)境下EC行為的理解提供了***種強(qiáng)大的工具。

體內(nèi)血管微環(huán)境包括持續(xù)暴露于血流剪切力，這在血管形成和維持血管功能方面發(fā)揮著重要作用。搏動(dòng)性血流由左心室周期性收縮產(chǎn)生，并維持在整個(gè)動(dòng)脈以及靜脈和毛細(xì)血管的特定區(qū)域。血流與心室收縮緊密相關(guān)，因此心律失常會(huì)影響外周血流模式。內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)排列在血管腔內(nèi)，因此與恒定流相比，搏動(dòng)性血流為這些ECs提供了更相關(guān)的體內(nèi)微環(huán)境。大量研究表明，體外搏動(dòng)性血流和恒定流對(duì)ECs有不同的影響，包括EC形態(tài)和排列、基因表達(dá)、粘附蛋白分布、細(xì)胞增殖和凋亡。搏動(dòng)性血流的脈動(dòng)頻率和峰值振幅也在EC形態(tài)和蛋白表達(dá)方面發(fā)揮著重要作用。此外，流體剪切力顯著影響分化和分化后的血管壁。在分化過(guò)程中，脈動(dòng)剪切力的影響尚未得到很好的表征。EC分化涉及多個(gè)血管形成過(guò)程，包括血管發(fā)生和血管生成，而這些新的血管形成過(guò)程受到剪切力的關(guān)鍵影響。EC在心血管系統(tǒng)中有多種功能，包括屏障保護(hù)、內(nèi)分泌信號(hào)和炎癥反應(yīng)。EC功能障礙可導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化和血栓形成等血管疾病，以及心肌梗死和卒中。因此，開(kāi)發(fā)具有更生物學(xué)相關(guān)的脈動(dòng)流廓線的心血管模型，以更好地模擬血管發(fā)育和疾病，是非常重要的。

搏動(dòng)性血流由于其對(duì)細(xì)胞和組織的生物力學(xué)效應(yīng)，是體外研究血管生物學(xué)的關(guān)鍵組成部分。以前體外研究?jī)?nèi)皮細(xì)胞行為的方法使用氣動(dòng)或壓電壓力泵和模擬波形產(chǎn)生搏動(dòng)性血流。然而，這些以前方法的基礎(chǔ)泵技術(shù)缺乏時(shí)間分辨率，無(wú)法重現(xiàn)心臟收縮產(chǎn)生的時(shí)變血流的頻率內(nèi)容。此外，這些以前研究的模擬搏動(dòng)波形不能提供反饋流或藥物治療引起的波形實(shí)時(shí)變化。因此，這些以前的方法無(wú)法在體外研究動(dòng)態(tài)生物力學(xué)變化對(duì)心血管系統(tǒng)的長(zhǎng)期影響。雖然以前的研究表明，與恒定血流相比，搏動(dòng)性血流改變了內(nèi)皮細(xì)胞的功能和形態(tài)，但由于目前體外模型的局限性，無(wú)法確定病理性搏動(dòng)性血流(如長(zhǎng)QT綜合征)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的患者特異性影響。因此，需要***種新的體外模型來(lái)產(chǎn)生脈動(dòng)流，以捕捉藥物治療或患者特異性病理流的細(xì)微流體差異，以促進(jìn)心血管系統(tǒng)的藥物篩選和疾病建模。

人類多能干細(xì)胞(hPSC)來(lái)源的心肌細(xì)胞已被用于模擬基因突變對(duì)心肌細(xì)胞功能的影響，并能夠重現(xiàn)病理生理學(xué)表型19。然而，這些突變對(duì)更廣泛的心血管系統(tǒng)(包括血管)的影響尚未在當(dāng)前hPSC來(lái)源的心肌細(xì)胞疾病模型中進(jìn)行研究。此外，hPSC來(lái)源的心肌細(xì)胞提供了無(wú)限的和可重復(fù)的細(xì)胞來(lái)源，以測(cè)試心肌細(xì)胞在藥物治療和機(jī)械刺激下收縮的變化。此外，它們可以用于模擬包括LQTS在內(nèi)的多種心臟疾病的表型心臟收縮。心肌細(xì)胞收縮的關(guān)鍵特征，包括頻率和振幅，與搏動(dòng)血流密切相關(guān)。至關(guān)重要的是，它們可以通過(guò)高速定量成像和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)化為信號(hào)，以產(chǎn)生生物相關(guān)的搏動(dòng)血流。

我們展示了***種新型的自適應(yīng)泵(Adapt-Pump)系統(tǒng)，基于患者特異性hPSC衍生心臟球體(CSs)的收縮產(chǎn)生生理和病理相關(guān)的脈動(dòng)流。我們開(kāi)發(fā)了基于定量成像的信號(hào)傳導(dǎo)，以記錄CSs的自發(fā)周期性收縮，并以高保真度作為微流體脈動(dòng)流驅(qū)動(dòng)收縮波形。我們使用Adapt-Pump從不同hPSC系的CSs中產(chǎn)生脈動(dòng)流，包括健康人胚胎干細(xì)胞(hESC)衍生的CSs和患者特異性LQTS誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(iPSC)衍生的CSs。然后，我們解決了藥物治療對(duì)CS收縮的影響，并準(zhǔn)確地在微流體脈動(dòng)流中重現(xiàn)這些收縮。我們還展示了實(shí)時(shí)Adapt-Pump(rtAdapt-Pump)，并解決了CS收縮對(duì)微流體機(jī)械刺激的瞬時(shí)響應(yīng)。Adapt-Pump還被用于將脈動(dòng)流應(yīng)用于EC祖細(xì)胞，我們發(fā)現(xiàn)LQTS衍生的脈動(dòng)流在EC分化過(guò)程中誘導(dǎo)了異常的細(xì)胞組織。該Adapt-Pump系統(tǒng)可以通過(guò)基于定量成像的信號(hào)傳導(dǎo)從hPSC衍生的CSs產(chǎn)生生理或病理相關(guān)的搏動(dòng)流，這是***種新技術(shù)，使心血管系統(tǒng)的集成模型前所未有。Adapt-Pump可用于研究心臟疾病在臨床相關(guān)藥物治療下產(chǎn)生的各種機(jī)械微環(huán)境下心肌細(xì)胞和EC的綜合行為。

在這里，hPSC-CSs收縮剖面的定量成像和高速微流體泵結(jié)合到Adapt-Pump系統(tǒng)中，以產(chǎn)生生物驅(qū)動(dòng)的脈動(dòng)流，以促進(jìn)心血管系統(tǒng)的建模。以前產(chǎn)生脈動(dòng)流的方法是基于慢壓泵和模擬波形，這不能完全復(fù)制ECs經(jīng)歷的體內(nèi)機(jī)械微環(huán)境。這里展示的Adapt-Pump系統(tǒng)可以重現(xiàn)正常和患病心臟波形之間的差異，包括高時(shí)間分辨率的可變脈動(dòng)幅度、持續(xù)時(shí)間和頻率。

Adapt-Pump系統(tǒng)還可以捕獲心臟藥物治療后脈動(dòng)流的動(dòng)態(tài)變化，重現(xiàn)體內(nèi)心臟藥物反應(yīng)，并可以實(shí)時(shí)執(zhí)行，以了解CS收縮的反饋機(jī)制。我們已經(jīng)證明，該系統(tǒng)可以模擬與生物相關(guān)的脈動(dòng)流。在這里，我們使用縮放因子轉(zhuǎn)換CS收縮期間橫截面積的變化，以模擬心臟脈動(dòng)流的輸出壓力。我們的2D圖像不反映CS軸向尺寸的變化，因此未來(lái)可以使用3D成像來(lái)提供CS收縮的體積變化。在未來(lái)的研究中，應(yīng)該考慮更復(fù)雜的計(jì)算模型，以將CS收縮轉(zhuǎn)換為特定條件下的流動(dòng)力學(xué)(例如，不同的血管位置和發(fā)育階段)。與本系統(tǒng)未建模的脈動(dòng)流動(dòng)力學(xué)有關(guān)的重要因素包括與主動(dòng)脈瓣的相互作用、周圍血管系統(tǒng)和血管彈性。

此外，通過(guò)使用0.2 mm-ibidi μslide和***大輸入壓力1 bar，該自適應(yīng)泵系統(tǒng)的剪切力范圍為0 dyne/cm2至約30 dyne/cm2。然而，可以通過(guò)使用更高的輸入壓力或更小的微通道來(lái)實(shí)現(xiàn)更高的剪切力。該系統(tǒng)的時(shí)間分辨率由Elveflow泵決定，其***小響應(yīng)時(shí)間為0.09秒。這些規(guī)格限制了可以用該系統(tǒng)測(cè)試的應(yīng)用程序。此外，對(duì)于長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞培養(yǎng)基必須由Eveflow MUX再循環(huán)裝置進(jìn)行再循環(huán)，該裝置具有開(kāi)關(guān)閥門(mén)，可周期性地暫時(shí)中斷脈動(dòng)流。

總的來(lái)說(shuō)，該系統(tǒng)可用于模擬心臟收縮對(duì)藥物治療和體外反饋流的實(shí)時(shí)響應(yīng)，研究心肌細(xì)胞和EC在與心臟疾病相關(guān)的機(jī)械微環(huán)境下的行為，并集成到生物驅(qū)動(dòng)的循環(huán)系統(tǒng)的芯片器官系統(tǒng)中。基因缺陷iPSCs已被用于體外疾病建模，包括LQTS模型。我們證明了從不同hPSCs產(chǎn)生的3D CSs重現(xiàn)了其基因型的心律特征，包括ESC源CSs的正常心臟收縮和LQTS iPSC源CSs的周期性拉長(zhǎng)收縮。心律失常導(dǎo)致的異常流量可能會(huì)影響EC生物學(xué)38，但現(xiàn)有的產(chǎn)生體外脈動(dòng)流的技術(shù)缺乏生物相關(guān)性，因?yàn)樗鼈兪褂玫氖呛铣傻男呐K收縮波形。我們的方法結(jié)合hPSC-CSs、高速定量圖像分析和快速信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，產(chǎn)生適應(yīng)hPSC基因型和藥物治療效果的脈動(dòng)流。

體內(nèi)的ECs持續(xù)暴露于脈動(dòng)血流的流體機(jī)械刺激，而流體剪切力影響ECs的行為和分化。我們發(fā)現(xiàn)脈動(dòng)流顯著提高了ECs的分化效率，這與先前的報(bào)道***致，即剪切力可以誘導(dǎo)ECs分化。我們還發(fā)現(xiàn)脈動(dòng)流增加了細(xì)胞核的厚度，這與先前的報(bào)道***致，即隨著流體流動(dòng)，ECs的核形狀發(fā)生變化。這些核形態(tài)學(xué)的變化可能是ECs對(duì)剪切力響應(yīng)的***個(gè)指示。脈動(dòng)流還增加了細(xì)胞大小，改變了內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子CD31和機(jī)械傳感器PIEZO1的分布，這表明ECs結(jié)構(gòu)受到脈動(dòng)流的影響。脈動(dòng)，包括頻率和振幅，在EC蛋白表達(dá)和形態(tài)學(xué)中發(fā)揮重要作用。已知紊亂的流動(dòng)會(huì)影響ECs的行為，包括EC周轉(zhuǎn)率、低密度脂蛋白滲透性、動(dòng)脈粥樣硬化和基因表達(dá)。然而，由于缺乏與心血管疾病相關(guān)的搏動(dòng)流產(chǎn)生方法，以前沒(méi)有對(duì)異常搏動(dòng)流和EC行為之間的關(guān)系進(jìn)行表征。通過(guò)本文提出的Adapt-Pump系統(tǒng)，LQTS產(chǎn)生的搏動(dòng)流在EC祖細(xì)胞分化過(guò)程中被應(yīng)用于EC組織，導(dǎo)致EC組織異常。然而，LQTS患者不會(huì)持續(xù)經(jīng)歷超過(guò)48小時(shí)的異常搏動(dòng)流，相反，這些患者在***生中會(huì)周期性地經(jīng)歷心律失常。先天性心臟病引起的這些異常搏動(dòng)流對(duì)EC生物學(xué)的長(zhǎng)期影響尚不清楚，但我們的概念驗(yàn)證EC分化研究表明，異常搏動(dòng)剪切應(yīng)力可以顯著影響EC行為。

這些研究中使用的hPSC-CS來(lái)源的脈動(dòng)流也反映了不同心臟疾病之間波形的細(xì)微差異，這可以為研究心血管疾病和心臟藥物對(duì)心臟收縮和內(nèi)皮細(xì)胞的力學(xué)后果提供***個(gè)強(qiáng)大的平臺(tái)。 后續(xù)對(duì)Adapt-Pump系統(tǒng)中細(xì)胞的分子和遺傳特征的研究可以提高我們對(duì)生理和病理?xiàng)l件下心臟和內(nèi)皮細(xì)胞的理解，指導(dǎo)改善患者的治療。

脈動(dòng)和穩(wěn)態(tài)流是通過(guò)連接到真空泵(-1930 mbar)和空壓機(jī)(6890 mbar)的壓力控制器(Elveflow OB1 MK3)產(chǎn)生的。該控制器提供了重現(xiàn)球形收縮波形所需的快速壓力調(diào)制(9 ms響應(yīng)時(shí)間，35 ms穩(wěn)定時(shí)間，122 μbar壓力分辨率)。本研究中使用的控制器配置了兩個(gè)通道，輸出壓力從-900 mbar到1000 mbar。對(duì)于流量驗(yàn)證研究，其中***個(gè)通道連接到儲(chǔ)液池，用于通過(guò)流道產(chǎn)生單向流動(dòng)。對(duì)于長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)，使用了***個(gè)再循環(huán)回路，包括兩個(gè)通道，每個(gè)通道連接到***個(gè)儲(chǔ)液池和***個(gè)流量循環(huán)閥(Elveflow MUX Injector)，這是***個(gè)6端口/2位置閥門(mén)，允許在兩種配置之間快速切換。這使得在兩個(gè)儲(chǔ)液池之間再循環(huán)介質(zhì)時(shí)，可以通過(guò)流道保持單向流動(dòng)。聚四氟乙烯PTFE管(1/16“內(nèi)徑)用于在儲(chǔ)液池和流道之間傳輸液體介質(zhì)。使用自定義腳本控制壓力控制器和流量開(kāi)關(guān)，通過(guò)流道產(chǎn)生脈動(dòng)流。所有泵控制均使用MATLAB 2018b (MathWorks)實(shí)現(xiàn)。

圖1：產(chǎn)生脈動(dòng)流的工作流程示意圖。(a)奇異hPSCs在mTeSR1中播種并擴(kuò)增2天。向心臟祖細(xì)胞分化遵循先前的協(xié)議，采用連續(xù)的Wnt激活和抑制。心臟球體(CS)由心臟祖細(xì)胞生成，并嵌入Matrigel中，用于進(jìn)***步的心臟收縮成像。(b)hPSC衍生的CS成像。使用定制腳本分析這些時(shí)間序列圖像，并從CS收縮中提取脈動(dòng)波形。(c)收縮波形轉(zhuǎn)換為脈動(dòng)波形，并發(fā)送到Elveflow OB1泵。Elveflow MUX注射系統(tǒng)用于循環(huán)細(xì)胞培養(yǎng)基。流體脈動(dòng)剪切應(yīng)力應(yīng)用于ibidi μ-slides中播種的EC祖細(xì)胞，用于EC分化研究。

圖2：熒光珠速度測(cè)量和剪切應(yīng)力模擬。(a)用于流動(dòng)珠條紋測(cè)量和剪切應(yīng)力模擬的ibidi μ滑動(dòng)通道示意圖。尺寸標(biāo)記。流向用紫色箭頭表示。Z位置為0.8 mm,0.7 mm,0.6 mm，和0.5 mm的測(cè)量標(biāo)記為“1”，“2”，“3”，“4”(b)熒光珠條紋的代表性圖像(原始和圖像處理步驟后，或“處理”)從z位置0.8 mm(“1”)，0.7 mm(“2”)，0.6 mm(“3”)，和0.5 mm(“4”)在200 mbar壓力下生成。(c)使用自定義算法計(jì)算不同通道z位置(1-4)的熒光珠速度。流道內(nèi)的焦平面高度(單位：微米)為z。 壓力已標(biāo)示。計(jì)算流體動(dòng)力學(xué)模擬流速(d)和剪切應(yīng)力(e)在800 mbar的Elveflow泵輸出分別呈現(xiàn)在前視圖中。

剪切力由通道頂部(z深度為795 μm)的條紋長(zhǎng)度測(cè)量值計(jì)算得出。由于流型的對(duì)稱性，該剪切力值假定在通道底部(z深度為5 μm)是等效的。選擇z深度為5 μm是因?yàn)檫@是在底部表面(0 μm)播種的EC的平均厚度，因此在長(zhǎng)期EC分化過(guò)程中，它們將處于剪切力作用的位置。輸入壓力為800 mbar時(shí)，在ibidi 0.8 mm μslide中產(chǎn)生的剪切力約為11 dyne/cm2(圖2c-e)。這些表征研究證實(shí)，Adapted-Pump系統(tǒng)可以產(chǎn)生不同水平的層流。

圖3. hPSC-CS收縮波形和流體脈動(dòng)波形的表征。(a) H1 ESC衍生的CS的代表性明場(chǎng)圖像。(b) 通過(guò)定制算法提取的代表性hPSC-CS收縮波形的H1 ESC-CSs, H9 ESC-CSs和LQTS iPSC-CSs。峰值收縮幅度標(biāo)準(zhǔn)化為1。紅色箭頭表示長(zhǎng)持續(xù)收縮，紅色矩形表示***系列快速收縮。(c) 150 mbar壓力從Erveflow泵發(fā)出，標(biāo)準(zhǔn)化收縮幅度為1。不同時(shí)間點(diǎn)流動(dòng)珠子的代表性熒光顯微鏡圖像。(d) 使用定制算法計(jì)算流動(dòng)珠子的速度，由熒光顯微鏡下H1 ESC-CSs, H9 ESC-CSs和LQTS iPSC-CSs的脈動(dòng)收縮波形驅(qū)動(dòng)。波形包括平均(實(shí)線)和掃描電鏡(陰影線)。

圖4. 藥物治療前后hPSC-CS收縮波形和流體脈動(dòng)波形的表征。(a) 用實(shí)時(shí)顯微鏡記錄了代表性的H9 hESC-CS在1 μM verapamil治療10分鐘前后的收縮，并通過(guò)自定義算法計(jì)算。(b) 維拉帕米治療前后H9 ESC-CS的歸***化收縮幅度、收縮頻率和收縮持續(xù)時(shí)間(黑線表示平均± SEM)。收縮波形由60秒內(nèi)的單個(gè)收縮計(jì)算。(c) 從Erveflow泵發(fā)出150 mbar壓力作為歸***化收縮幅度1。用實(shí)時(shí)顯微鏡記錄了代表性的珠速度，并通過(guò)自定義算法計(jì)算。(d) 用實(shí)時(shí)顯微鏡記錄了代表性的LQTS iPSC-CS在1 μM硝苯地平治療10分鐘前后的收縮，并通過(guò)自定義算法計(jì)算。(e) 硝苯地平治療前后LQTS iPSC-CS的歸***化收縮幅度、收縮頻率和收縮持續(xù)時(shí)間以平均± SEM表示。收縮波形由60秒內(nèi)的單個(gè)收縮計(jì)算得出。(f)代表性珠速。兩組之間的統(tǒng)計(jì)顯著性由學(xué)生t檢驗(yàn)(雙尾)確定。****P<0.0001。

圖5. hPSC-CS對(duì)流體機(jī)械刺激的響應(yīng)收縮。(a)芯片心臟模型CS收縮反饋對(duì)流體機(jī)械刺激的響應(yīng)示意圖。CSs被嵌入Matrigel中并被鍍到0.8mm ibidi sticky μ-slide的微通道中(下腔)。下腔被聚酯膜密封并覆蓋另***個(gè)0.8mm ibidi sticky μ-slide(上腔)。上腔充滿了CS培養(yǎng)基。對(duì)于靜態(tài)條件下的收縮，CSs***先在向球體施加流體流動(dòng)之前用明視野顯微鏡成像。對(duì)于流體機(jī)械刺激后的收縮響應(yīng)，CSs被成像，收縮波形同時(shí)由計(jì)算機(jī)分析。脈動(dòng)流信號(hào)立即被發(fā)送到泵，流體流被施加到CSs。明視野顯微鏡記錄了球體對(duì)脈動(dòng)流的響應(yīng)收縮。所有信號(hào)都由定制算法分析。(b)流體流動(dòng)刺激前后的代表性球體收縮波形。(c)收縮的峰值收縮幅度、收縮持續(xù)時(shí)間和曲線下面積(AUC)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。所有的收縮波形均由30秒內(nèi)的單個(gè)收縮計(jì)算得出。兩組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性通過(guò)學(xué)生t檢驗(yàn)(雙尾)確定。****P<0.0001。

圖6. 流體脈動(dòng)流影響EC分化效率和形態(tài)。(a)EC祖細(xì)胞在靜態(tài)條件下或hPSC來(lái)源的脈動(dòng)流條件下分化，如圖1c所示。分化48小時(shí)后，EC用抗CD31(綠色)和DAPI(白色)進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記。紅色箭頭表示非內(nèi)皮細(xì)胞，(b)EC種群通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)用CD31標(biāo)記從三個(gè)獨(dú)立的生物復(fù)制量化，并表示為平均值± SEM。細(xì)胞外CD31表達(dá)水平通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)在沒(méi)有膜滲透性的情況下量化為CD31+種群的平均熒光強(qiáng)度(MFI)。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性由學(xué)生t檢驗(yàn)(雙尾)(c)確定?？侰D31表達(dá)(MFI)(d)和EC大小(前向散射，F(xiàn)SC)(e)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)在膜滲透性下量化。CD31+種群被門(mén)控，并顯示在直方圖中。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性由學(xué)生t檢驗(yàn)(雙尾)確定。(f)靜態(tài)條件下分化后的ECs,H9-CS源的脈動(dòng)流條件，LQTS-CS源的脈動(dòng)流條件。分化48小時(shí)后，ECs用抗CD31(綠色)和抗PIEZO1(品紅色)免疫熒光標(biāo)記，并用DAPI(白色)染色。標(biāo)記細(xì)胞用0.5 μm Z步長(zhǎng)成像。紅色圓圈表示非內(nèi)皮細(xì)胞群，紅色箭頭表示異常EC集群。(g,h)圖像在ImageJ中重建，核形態(tài)被量化。數(shù)據(jù)收集自至少三個(gè)獨(dú)立分化，并以均值±標(biāo)準(zhǔn)差繪制。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性由單因素方差分析(ANOVA)確定，然后是Tukey事后檢驗(yàn)。*p<0.05，**p<0.01。

(文章來(lái)源于儀器網(wǎng))